紫外/可见光对药物分子检测分析技术

最常用的药物分子检测分析技术是反相高效液相色谱 (RP-HPLC)，采用紫外 (UV)/可见光检测。然而，影响紫外/可见光检测器的最大限制之一是它们无法对缺乏合适紫外发色团的分析物产生足够的灵敏度。

高效液相色谱中的通用检测

这些化合物包括一个令人惊讶的大组，包括天然产物，特别是发酵产物、碳水化合物、脂质、某些氨基酸、类固醇、双膦酸盐、烷化剂、赋形剂、聚合物、表面活性剂等（一些代表性的参见图 1，第 50 页结构）。其次，当使用 UV 检测系统时，通常假设杂质的响应因子与母体的响应因子相同，但通常它们不是1。因此，纯度评估不可避免地会受到一定程度的影响。这篇简短的评论将着眼于一些较新的检测系统的使用以及各种检测器类型的优缺点。连字符技术如 HPLC-NMR 和 HPLC-MS 已被有意排除在外。

历史上，折光率 (RI)、间接 UV/可见光或柱后衍生化（随后是 UV/可见光检测）和电导率都被用来解决 HPLC 分析中的缺陷。同时，气相色谱/火焰离子化检测器 (GC/FID) 已被用作检测挥发性更强的分析物的通用检测器。然而，这些替代检测方法也有内在的局限性。

在过去几十年中开发的用于非发色分析物的新型检测器已进入相当普遍的用途。这些包括基于气溶胶的检测系统，例如蒸发光散射检测 (ELSD)、密切相关的纳米量分析物检测器 (NQAD)，有时也称为凝结成核光散射检测 (CNSLD)、电晕充电气溶胶检测 ( CAD）和化学发光氮特异性检测（CLND）

根据选择性进行检测器分类

甲通用型检测器被定义为其中一个“可对每一个组件在柱流出物除了流动相响应” 2。相比之下，选择性检测器被定义为“对柱流出物中相关的一组样品组分做出响应的检测器”。最后，特定检测器被定义为“对单个样品成分或有限数量的具有相似化学特性的成分做出响应的检测器”。人们还普遍认识到，没有单一的 HPLC 检测器能够“从给定的色谱洗脱液中区分所有可能的分析物，因此，通用术语经常被重新定义以描述对各种分析物的检测” 3。

最早的探测器

差示折射率检测 (RI) 检测器是最早的通用检测器之一。它们本质上是非破坏性的，而 RI 是一种“浓度依赖性整体特性”，可测量样品和流动相之间折射率的变化，并将检测所有含有可极化电子的化合物4。差分 RI 检测器是最早的 HPLC 检测器之一，由独立的温度控制样品和参考流通池组成，允许样品灵敏度为 10 -7折光率单位，相当于约 0.1% 的检测水平 (DL)。然而，使用参比池排除了梯度分离的使用，因为很难实现快速的热平衡。话虽如此，已尝试对基本设计进行许多调整以尝试提高灵敏度，但成功率有限。

间接紫外/可见光检测

间接紫外线/可见光色谱是一种间接检测非发色团或“透明”离子的过程，其中将高度吸收紫外线的反离子（例如萘磺酸）添加到流动相中。这种吸收紫外线的反离子负责非发色分析物的间接检测。间接 UV/可见光色谱已用于分离和间接检测许多非发色分析物离子，包括药物制剂中常用的杂质和赋形剂5。

电导检测器

电导检测器 (CD) 测量洗脱液的电导率，该电导率将根据主要离子的浓度而改变。CD 与离子色谱或离子交换色谱结合使用，用于不含发色团的离子，例如 Na +、K +、Cl –、SO 4 2-等。 在电导检测器中，两个电极之间的阻抗（或电阻）在流动池中被监控。通常，抑制柱插入检测器前（分析后柱）以最小化洗脱液6 的背景电导。

基于气溶胶的探测器

基于气溶胶的检测器（ELSD、CNLSD/NQAD、CAD）是一个检测器系列，能够根据与流动相相比的差异挥发性来检测分析物。ELSD 和 CNLSD/NQAD 基于光散射检测，而 CAD 基于带电气溶胶检测。基于气溶胶的检测器采用三阶段过程，包括 (i) 雾化、(ii) 蒸发和 (iii) 检测。初始阶段包括在载气流（通常是氮气）中雾化洗脱液，然后从雾化的液滴中去除流动相，最后，剩余的颗粒（比流动相挥发性低）由合适的探测器。

蒸发光散射检测

蒸发光散射检测 (ELSD) 包括雾化，然后在漂移管中蒸发，然后测量产生的光散射。载气流速和漂移管温度需要根据流动相成分进行优化。检测器响应与存在的分析物的绝对量成正比。该技术可用于梯度，并且对温度或流速变化不敏感。流动相需要具有挥发性，并且往往类似于 HPLC-MS( n )所用的流动相。

ELSD 显示响应的可变性，即使在结构相似的化合物之间也是如此，通常归因于“色谱柱流失”。有证据表明，随着流动相的沸点降低7，准确性会降低。该检测器具有粒径截止值，无法分析小于 0.1 微米的颗粒3。

缩合成核光散射检测或纳米量分析物检测器

这是 ESLD 的变体。在冷凝成核光散射检测器或纳米量分析物检测器 (CNLSD/NQAD) 中，在洗脱液雾化后，将饱和溶剂流加入富含颗粒的载气中。溶剂凝结在颗粒上，增加了它们的尺寸和随后在光束中的可检测性。粒径的增加使灵敏度提高了 10-100 倍，线性范围比 ELSD 8 中的范围更广。

Chemmalil 和同事9使用亲水相互作用液相色谱 (HILIC) 和 CNLSD/NQAD 检测来量化糖蛋白中的唾液酸，治疗蛋白的酸水解后。该方法可能与其他分析方法密切相关，例如使用 1,2-二氨基-4,5-亚甲二氧基苯 (DMB) 进行柱前衍生化的 HPLC 或使用脉冲安培检测 (HPAEC-PAD) 的高 pH 阴离子交换色谱法. CNLSD/NQAD 方法比衍生化方法更有效，并且比 HPAEC-PAD 方法更具可重复性。CNLSD/NQAD 方法灵敏度高，色谱柱上的 DL 和 QL 分别为 0.32 和 0.86 nmol，并且在 DL 值处显示了适当的精度 (9% RSD)。

带电晕的气溶胶检测 (CAD)

在电晕充电气溶胶检测( CAD) 中，雾化的液滴被带入加热的漂移管中，在那里它们被蒸发并使用正电晕放电充电，然后在电气溶胶检测器中检测到。检测的先决条件是分析物的挥发性远低于流动相，这反过来限制了流动相的选择。但是，某些不能在典型 HPLC 中使用的溶剂（例如，由于 330nm 的高 UV 截止值而使用丙酮）可以在 CAD 中使用，因为它们具有更大的挥发性。固定相也仅限于显示很少或没有流失的色谱柱10. 因此，重要的是要认识到该检测器对流动相和固定相的选择都有影响。例如，对于相同的分析物，HILIC 可以获得比 HPLC 更高的灵敏度，这归因于 HILIC 流动相的挥发性增加。在 HILIC 模式11中，CAD 的灵敏度大约高出 10 倍。

检测器灵敏度不依赖于分析物内的特定功能，因此可以预期在广泛的不同功能中会有类似的检测器响应。但是，挥发性或电离性的差异可能会导致 CAD 输出的差异。例如，当从 100% 水性成分变为 100% 有机成分时，检测器输出可以提高 5-10 倍，这可能是一个限制因素。这可以使用柱后反梯度解决，双泵系统现已上市。列12上的典型 QL 介于 1-240ng 之间，高于相应的 ESLD 系统12,13。

与 UV/可见光检测器不同，CAD 响应在宽动态范围14内不是直接线性的，但已显示在两个数量级上呈线性，这确保了检测器适用于使用外标方法13 的杂质检测。

化学发光氮特异性检测

化学发光氮特异性检测器 (CNLD) 是一种氮特异性检测器，利用流动相流出物在 1050°C 的富氧炉中燃烧，促进所有有机物质转化为其相应的氧化物，即碳、氮、硫氧化物和残留水。一氧化氮然后与臭氧反应以产生处于激发态的二氧化氮，当返回到基态15时，它将发射预定能量的光子。这种化学发光反应与分析物中存在的氮量（以摩尔计）成正比。除了N=N和游离元素氮，响应与结构无关，这可用于在没有分析物参考标准的情况下定量混合物中已知分析物的量。通过使用与 CNLD 检测器串联的 UV/可见光检测器，可以评估每个峰的 RRF（相对响应因子）。对于未知杂质，可以使用HPLC-MS( n ) 来确定准确的质量数/分子式。CLND 仅限于不含氮的洗脱液，因此排除了乙腈和胺改性剂。此外，CLND 需要使用易失性缓冲区。

使用 CLND可以为结构差异很大的化合物16,17实现相当好的准确度（±20% 与质量回收率）。这种方法与相关物质（杂质和降解物）的定量非常一致，无需单独的参考标准17。然而，有限的线性动态范围是一个障碍。使用与感兴趣的杂质相似浓度的参考标准的二次稀释可以解决这个问题。与经典 UV 检测相比，CNLD 的峰拖尾更为明显。检测器的复杂性很高，会对操作员培训、维护费用和在 QC 环境中的使用产生影响7. 流速低，雾化器/加热炉可能会被残留物污染15。

通用检测的未来展望

通用检测的大部分技术进步都集中在许多领域，包括用于收集和分析数据的硬件、软件和集成技术的改进（其中大部分已在前面的部分中描述）和互补检测模式的连字符以提高灵敏度和扩大选择性。

后一种方法涉及将互补检测器耦合在一起，可以在通用检测中提供显着优势，特别是在样品由紫外线和非紫外线吸收同系物的混合物组成的情况下。这在离子色谱 (IC) 中得到了例证，其中包含抑制系统以允许分光光度检测器与通用雾化系统的耦合，可以增强对无机和有机带电化合物的分析并扩大其选择性。

IC 中的抑制可以使用化学（通过 Anion-ICE 微膜抑制器；AMMS）或电解（通过阴离子自再生抑制器；ASRS）连接多个检测器来实现，从而避免由于非线性响应引起的干扰和不兼容，降低基线漂移等。联用方法已应用于糖蛋白中碳水化合物的分析，通过 LC-MS-CAD 18和使用 GC-ICP-MS 19 的痕量杂质分析。

结论

通常情况下，没有一种检测器普遍适用于所有非紫外线吸收分析物。在许多方面，间接紫外/可见光检测是一种非常实用的方法，利用紫外/可见光检测器的所有感知优势，同时能够检测非发色团分析物。它最大的缺点是灵敏度差。对于古老的 RI 检测器，也可以得出类似的结论。然而，最近的一些应用给了一些希望能够及时解决灵敏度和选择性差（后者由与 HPLC 梯度不兼容引起）的问题。电导检测器是离子交换色谱中用于阴离子和阳离子分离和定量的首选检测器。

然而，对特定设备和色谱柱的需求以及对抑制流动相潜在电导率的要求确保了其将继续仅具有利基应用。气溶胶光散射检测器（ELSD 和 CNLSD）已显示出广泛的适用性，但缺乏重现性和非线性信号响应（通常为对数线性）导致了操作问题。CAD 已经解决了其中的许多问题，并且与 HILIC 一起非常敏感。然而，它仍然需要挥发性流动相。CNLD 对 CAD 也同样敏感，并且不受易失性缓冲区的限制；但是，它仅限于含氮化合物，并且不能在流动相中使用乙腈或胺改性剂。因此，由分析师权衡利弊（见表 1) 并选择最适合其特定需求的选项。使用检测器的组合是很常见的，例如，UV、RI 和基于气溶胶的检测器。