使用紫外-可见光谱仪分析核酸的熔融温度和热力学参数

介绍

近年来，从核酸（如 DNA 或 RNA）衍生的基于寡核苷酸的疗法的使用显着增加。由于两个重要因素，它们被认为是下一代药物：首先，它们不仅作用于传统上被常规小分子或抗体基础药物靶向的蛋白质，而且作用于功能性 RNA，如 mRNA 和 miRNA，以及其次，它们可以通过化学合成制造，这意味着它们可以很容易地批量生产。寡核苷酸疗法主要基于人工寡核苷酸，它们是化学修饰的 DNA 或 RNA，可提高其在人体内的结构稳定性和对其靶分子的亲和力1）。评估它们与靶分子的相互作用特性和用作药物，优化它们的碱基数量和序列是至关重要的。因此，已明确定义了用于优化这些特性的检查和评估方法的重要性。热力学性质的重要性已经得到强调，因此需要一种有效的方法来分析这些特性。

本应用说明报告了对核酸样品的解链温度和热力学参数的评估。使用 V-700 系列紫外-可见分光光度计和 PAC-743 自动 6/8 位珀耳帖电池更换器，可同时测量多达八个样品，同时测量不同样品浓度在 260 nm 处的吸光度，同时升高温度2 )。

实验性的

熔点温度

当双链 DNA (dsDNA) 被加热时，有助于形成双链的相互作用力如碱基对之间的氢键减弱，导致双链 DNA (ssDNA) 分离成两条单链 DNA (ssDNA)。这种离解被描述为DNA解链（图1），并且在该双链DNA解离成单链DNA的一半被定义为熔融温度（温度Ť米）。

构成 DNA、RNA 和人工寡核苷酸的核碱基几乎都在紫外线区域具有吸光度，并且通常在 260 nm 附近具有最大峰值。例如，在dsDNA中，碱基以堆叠相互作用排列，这使得整个dsDNA的吸光度小于每个碱基的吸光度之和。然而，当 dsDNA 解离成 ssDNA 时，碱基不再结合，导致比 dsDNA 更大的吸光度。使用这种现象，Tm 可以通过测量 UV 区域的吸光度同时升高温度来计算。

热力学参数

自由能 ( ΔG° ) 由下式表示，当ΔG°为负时，反应或络合物的形成自发发生（图 2）。

∆G° = ∆H°−T∆S° (1)

众所周知，在大多数化学和生物相互作用中，焓变 ( ΔH° ) 和熵变 ( ΔS °)之间存在相关性。这种相关性被描述为焓熵补偿：当∆H°有利 ( ∆H°

在分子相互作用和络合物形成中，当负 ∆H° 对∆G°的影响大于负∆S° 时，被认为是焓驱动的，反之，当正∆S的影响ΔG °上的°克服了正ΔH° 的°，它被认为是熵驱动的（图 3）。在水中发生的生物分子相互作用中，氢键通常被认为是焓驱动相互作用的驱动力，疏水作用被估计是熵驱动相互作用的驱动力3),4 )。因此，ΔH°和ΔS°的评估能够估计相互作用的驱动力和趋势。因此，它可用于复杂结构的估计和更稳定复合物的分子设计。

测定4 μmol/L、8 μmol/L、20 μmol/L和40 μmol/L*核酸(5'-TGCAAGACTATAAGATTC-3')溶液的熔解曲线。使用带有 PAC-743 自动 6/8 位 Peltier Cell Changer 的 V-730 紫外可见分光光度计进行测量。样品在 8 位微池中制备。测量和分析使用VWTP-959温度控制测量/DNA熔解分析。

*这些是 dsDNA 解离后的 ssDNA 浓度。

PAC-743 自动 6/8 位 Peltier 恒温电池更换器的特点

•单次运行最多可测量 8 个样品

•非常少量的样品，

   例如 100 μL 用于 10 mm 光程池，10 μL 用于 1 mm 光程池等。

•在测量过程中通过探针传感器准确监测温度

•通过密封盖防止样品蒸发

DNA 熔解分析程序的特点

•计算T m、 ∆H°、∆S°和 GC 含量

•通过

   1/ T m  vs. ln( C t /4) 图高精度计算热力学参数**

   * * ç吨表示的ssDNA的摩尔浓度

• 2序列相同链组成的双链DNA两者的分析和所述一个2序列不同链组成•一次进行多个数据的分析   

  在如下所示的条件下测量核酸的解链曲线。样品的T m由这些曲线计算，ΔH°和ΔS°由 1/ T m  vs. ln( C t /4) 图计算。

关键词

寡核苷酸治疗、寡核苷酸、核酸、热力学参数、焓、熵、PCR、Southern印迹、细胞内环境、分子拥挤

结果

不同浓度核酸的熔解曲线见图6。各溶液的Tm见表1，1/ T m  vs.ln( C t /4)曲线见图7。ΔH °和∆S°由绘图的近似线计算得出；分别为 -578.0 kJ/mol 和 -1.635 kJ/(mol·K)。

结论

结果表明，焓变极大地克服了核酸溶液dsDNA形成过程中的熵变。这表明样品的 dsDNA 形成是焓驱动的，这表明形成的驱动力主要是氢键和堆积相互作用。这一观察结果与 Watson 和 Crick 发现的 dsDNA 形成机制一致。

本应用笔记显示 PAC-743 可同时测量多个样品，同时准确监测温度。此外，可以通过使用 DNA 熔解分析程序计算T m、ΔH°和ΔS°来评估核酸的热稳定性和复合物的稳定性。不用说，Tm 的评估在 PCR（聚合酶链反应）和 Southern 印迹的使用中也很重要，它们是复制或检测 DNA 的常用方法。此外，T m  和热参数的评估是在分子拥挤环境下估计复合物形成的关键，细胞内环境的伪环境也一直受到关注。

我们认为，PAC-743 与 DNA Melting Analysis 程序的结合适用于有效获取有用信息，用于开发寡核苷酸疗法以及基于 DNA 和双螺旋形成的研究方法。